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，希望能够帮助到您。

2022-03-16引物设计及在线验证

你设计的引物是否有用?在做实验之前可以做一个电子PCR

qPCR引物设计+在线验证

方法一:NCBI上-probe

1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物,上面会给出上下游序列 。比如搜索小鼠nanog基因,它给出了这样的两条引物:

上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT

下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT

方法二:Primer3web

参考:Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计!-哔哩哔哩()

2.1.寻找基因序列

以humanp53为例进行引物设计
。

PubMed官网:

第一步:下拉条目选择核苷酸(Nucleotide)

第二步:输入基因+物种+mRNA(例如:p53humanmRNA)

第三步:点击搜索(Search)

第四步:单击选择左边栏的(mRNA4.782)

第五步:单击进入第一条(Homosapiens_mRNA_for_P53,completecds)为我们所寻找的p53humanmRNA

第六步:单击选择Features中的CDS选项

第七步:单击选择FASTA格式就会出现这个基因的CDS系列

2.2.开始设计引物

Primer3web官网:

/

进入Primer3web官网后,执行以下操作:

第一步:下拉条目选择物种(HUMAN)

第二步:在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列

第三步:单击获取引物(PickPrimers)

第四步:引物序列输出;在最终结果中,有四对引物供选择。

选择合适的引物:怎样算合适?

首先看看引物的就是扩增长度,100~300bp间比较好扩增;

引物长度在20~25bp较好,而且上下游引物间不要相差超过5bp;

再就是看看Tm值,60℃左右,相差不要超过1℃ 。

再加一点:

既然是设计qPCR引物,那么一定要跨外显子设计,这样可以避免基因组DNA的影响CT值,如果没有跨越外显子,则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小
。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢?

答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可 。

方法三:NCBI-BLAST-primer-blast

以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子,太麻烦了
。那么再普及更方便的办法。

参考:

3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列

打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNAandprotein
”前面那个NM***********,号码复制下来 。

注意:这个时候会看到有很多条NM****信息,表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚,一般选择最长的那条
。

3.2:开始设计跨越外显子的引物

打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站,将上面复制的mRNA编号输入序列框中,下拉选项中选择你的物种,然后在Exonjunctionspan下拉框选择Primermustspananexon-exonjunction,设置引物长度最小和最大值,然后点击Getprimer。就可以跳到Primer-BLASTResults页面 。这个过程会有点长,稍微等一下
。出来后,里面有个Graphicalviewofprimerpairs那一栏,会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。

在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对:

a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了 。(因为一个引物跨了内含子,这条引物就不会和基因组DNA匹配,就算另外一个引物和基因组DNA匹配了,一条引物是扩不出来东西的
。因为一条引物扩增达不到指数增长,扩了几十个循环后,信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中,只加上游或者下游引物,PCR出来绝对是没有东西的 。因为产量太低了
。)

b).一对引物之间的距离不要太长,因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好,过长会影响CT值变小。

验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢?可以做一个电子PCR看看 。

1.UCSC-Tools-In-SilicoPCR

进入UCSC,选择Tools的In-SilicoPCR,输入上下游引物,target选择genomeassembly,点击submit,或者如果这样出不来,记得勾选FlipReversePrimer
。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话,会出来一大段序列,上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因,看看目的基因的起始位置,就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了 。

注意:OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分,对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的,PCR出来的是两条引物之间的序列
。

进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址:Primerdesigningtool()

在primerparameter输入你刚刚设计的上下游引物

在database下拉选项选择RefseqmRNA

再点击Getprimer;

等一会,会卡一会才出来。

出来了一个Detailedprimerreports;上面写了Productsontargettemplate都是Homosapienstumorproteinp53(TP53)的不同转录本,且出来的产物长度也一样 。说明这对引物扩增出来的就是这个基因
。

两种验证方法优缺点:

UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列;

而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因,以及扩增出来的产物的长度。

选择:建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物,也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物 。

技术分享qPCR引物设计有妙招-知乎()

例如:Syt4(mouse)这个基因设计qPCR引物

step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号

step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中,勾选相应条件;,且限制了PCR产物长度在70-300之间;由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物:

上游:GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT

下游:CCAACCGTCCAATCACCTCA

step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中,点击Getprimers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因,说明这对引物特异性很好
。

step4:进入UCSC-Tools--In-SilicoPCR,输入上下游引物,点击提交,即可。如果跳转出来没有产物,则重新返回调整一下参数,比如说target参数,FlipReversePrimer:是否勾选等 。最终产物是Syt4,长度220bp
。说明这对引物的PCR产物特异性很高,只有这一个产物。

step5:进一步验证:由于设计引物时跨越了内含子,且已经提醒我是上游引物跨越了内含子,于是我进入NCBI-Nucleotide输入:Syt4MusmusculusmRNA,点击搜索,然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤,寻找这个基因的CDS序列,找到CDS序列后,搜索这两条上下游引物,发现在CDS区域中,且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中,仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224,确实跨越了两个外显子:exon1098..1218和exon1219..3901.

以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列 。可以直接让公司合成了
。

以上所讲的都是qPCR的引物设计,一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间,用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA,则用到Primer5软件 。扩增产物的长度可以自己在上面设置。

如何使用PrimerPremier5软件设计PCR引物-百度经验()

如何快速设计shRNA

在研究基因功能中,RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具
。其中shRNA慢病毒载体应用颇广,今天小编告诉大家2种方法可以快速设计构建到慢病毒载体中的shRNA。

1.Sigma网站

Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库,而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便 。

首先打开网址:

,以Fli1为例,直接输入基因名,点击search,出现以下界面:

在Products中找到并点击shRNA选项,然后出现这个界面:

点击“MISSIONshRNALentiviralTransductionParticles”这一行的PRICING,这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA:

当出现时,恭喜你,这个基因有被sigma验证过,下拉可以找到验证过的shRNA,用来构建慢病毒,简单有效,敲减效率基本上是有保证的
。如果没有验证过的shRNA,则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示:小编倾向选择CDS区的shRNA,3UTR基本不选,而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST,确保靶点是特异性的 。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA:

需要特别提醒,如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,sigma用的是pLKO.1载体,小编常用SBI的pGreenPuro(CMV)载体,两端的酶切位点是BamHI/EcoRI,设计出去的引物最终是这样的(不同shRNA替换中间红色部分):

Sense:GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense:AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

2.LifeTechnologies网站

LifeTechnologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件,操作非常方便,而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast,直接可以用的
。

首先打开网站:

,在TargetDesignOptions处选中shRNA,以Fli1为例,输入Accessionnumber或Nucleotidesequence,其他条件不变:

下拉到底点击RNAiDesign,然后出现推荐的10条靶点序列:

根据Rank评星,选择其中需要的(翠花一般选择4条,不同位置各一条),点击DesignshRNAOligos:

然后在DefaultLoopSequence选择合适的序列(翠花用的载体是pGreenPuro,不需要这个序列,就默认了,后面合成引物的时候要去掉的),在CustomLoopSequence处输入CTCGAG,点击Design:

得到shRNA

提醒:合成出去的引物需要做微调,根据载体的要求,和sigma的设计一样,需要在前后加上酶切位点的,最后大功告成。

在线设计qPCR引物网站（最后更新日期：2022.5.26）

第一次见于Up主:无Ct和没条带的视频#qPCR系列#傻瓜式设计定量引物+引物特异性查看

基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

双交换配子与亲本型配子中不同的基因位于中央,如:亲本是ec ct +∕+ + cv 双交换是+ + +∕ec ct cv那么与亲本不同的基因就是cv,所以cv在中间 。

双交换型与亲本对比 确定Aa位于中间，方法是观察三对基因中唯一不同的一对基因 原理是只有当Aa位于中间时发生双交换才能产生AaBbCc 
。

aabbCc  、aaBbcc
、 AabbCc、 aaBbcc  、AaBbCc 
、aabbcc这6种基因型两两与亲本型Aabbcc aaBbCc相比 也就是说先把C去掉 看AB 找出与亲本型不同的。

扩展资料：

用遗传学方法所测出来的只是重组率 ，而不是交换值 。

如果所研究的两个遗传标记相距较远
，或者说我们所关注的染色体片段比较长，其间可能发生双交换甚至多次交换 ，遗传学方法测定出来的重组率往往小于交换值
。

数目最多的是亲本的基因
，数目最少的是双交换的基因型，发生双交换时 ，只有中间的基因发生交换改变，两端的基因没有变化
，所以，将双交换型（最少类型）与亲型（最多类型）比较 ，有差异的基因位于中间。

参考资料：

百度百科——双交换

目前知道的miRNA有多少种？与肿瘤有关的
，在肝癌细胞中表达上调的，在组织中表达上调的 ，有代表性的是什么

基因表达调控主要实验技术有：ChIP、RIP 、RNA pull-down
、EMSA、Luciferase

1 、 ChIP实验

通过与染色质片段共沉淀和PCR技术
，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段 。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段
。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。

2、 RIP实验

RIP技术（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀） ，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术 。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来
，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合 ，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来
，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定
。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具 ，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

3
、RNA pull-down实验

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育
，形成RNA-蛋白质复合物 。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离
。复合物洗脱后 ，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

4 、EMSA实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术
，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用 、DNA定性和定量分析 。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链
。

5
、 Luciferase实验

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称 ，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。

萤光生成反应通常分为以下两步：

萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光

荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中
，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身 。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光 ，而发出的光子可以被光敏感元件
，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到
。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子 、药物筛选
、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测 、活细胞的实时动态研究
、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究 、RNA剪接研究 。

双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素
。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统
，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试 ，快速
、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件 、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应
、分析两个或多个通路之间的相互作用） 。

你好！你可以网上其他的回答
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。痛恨这些广告推销者，他们只会关心自己的钱包 ，不去考虑患者的疾病。希望你擦亮眼睛
，不要轻信这些虚假医疗广告，有病还是需要到专业的医疗单位治疗 ，等就是专业的肿瘤治疗单位 。

下边开始回答你的问题：MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA
，其大小长约20~25个核苷酸
。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体 ，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA
，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御 、造血过程
、器官形成、细胞增殖和凋亡 、脂肪代谢等等 。

最近的研究发现 ，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）
。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用
，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“oncomirs
”。

充当抑癌基因作用的miRNA:

mir-125b-1 ，位于染色体的11q24脆性位点
，乳腺癌
、肺癌、卵巢癌 、子宫癌病人中11q924位点常有缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因 。

65%B细胞慢性淋巴型白血病（CLL）病人 ，50%的套细胞淋巴瘤病人
，16-40%的骨髓瘤病人
、60%的前列腺癌病人中有13q14位点的缺失
。因此，在这个30Kb的区域中必定有一个肿瘤抑制基因的存在。而mir-15a和mir-16-1位于这一区域中一个功能未知的被称为LEU2的非编码蛋白的RNA基因的内含子区域 。Climmino等最近报道 ，miR-15a和miR-16-1负调控BCL2
，一个抗凋亡基因，因此 ，这两个miRNAs的缺失或下调
，导致了BCL2表达的升高，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。

有研究报道 ，mir-143和mir-145在结肠癌中明显下调
。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似
，这表明，可能是由于其成熟过程受到破坏。mir-143和mir-145的肿瘤抑制基因功能不仅仅局限于结肠癌 ，在乳腺癌 、前列腺癌
、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调 。

Takamizawa等发现肺癌病人的let-7表达显著降低
，并且这导致这些病人更差的预后，非小细胞肺癌病人的let-7表达水平越低 ，其预后越差
，术后生存期越短
。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的表达let-7可以抑制细胞的增殖 ，这也说明let-7在肺组织中可能是一个抑癌基因。实验表明
，在人类细胞中let-7通过3’非翻译区域直接抑制癌基因Ras的表达 。大约有15-30%的人类肿瘤都含有Ras突变，而激活的突变导致这个蛋白表达上升可以引起细胞转化
。因此 ，能够调节Ras蛋白表达的let-7
，可以控制细胞的增殖速度。

充当癌基因作用的miRNA：

miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加 。这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100倍
。反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。另一项独立研究 ，利用芯片来检测肿瘤和正常组织的245个miRNAs的表达水平，也发现胶质母细胞瘤中miR-21表达升高 。由于mir-21不是一个大脑特异性的基因
，在乳腺癌样品中表达也有增加，这个基因可能在肿瘤发生中起到广泛的作用
。

Metzler等人发现 ，在BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列
，编码mir-155的发夹结构。该研究组还发现在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表达量上升了100倍 ，此外的研究也发现
，Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中miR-155水平也有提高 。因此，mir-155可能是作为一个癌基因和MYC协同作用 ，而其正常功能是在B细胞的分化中起作用
，其可能的靶基因是那些对抗MYC信号通路的基因。

He等人最近发表的论文发现在散布的B细胞淋巴瘤 、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常常有13q31位点的扩增
。而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的RNA，C13orf25 ，这个转录本编码了mir-17-92基因簇
，其中包含了7个miRNAs：miR-17-5p，miR-17-3p ，miR-18a，miR-19a
，miR-20a，miR-19b-1 ，and miR-92-1。他们由此推断
，这个基因簇的过表达与肿瘤形成有关，而后通过实验研究证明 ，过表达Myc和mir-17-19-b1基因簇淋巴癌与仅有Myc过表达肿瘤相比较
，具有更强的增殖能力，更低的细胞死亡率 。这些实验证实 ，mir-17-19-b1中的miRNAs可以协同地行使癌基因的功能
，其靶基因可能是在MYC过表达条件下激活的凋亡蛋白
。当凋亡途径被mir-17-19-b1去除，MYC可以诱导细胞不受控制地增殖 ，这导致了肿瘤发生。

O’Donnell等人单独证明了mir-17-92基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因 。他们用miRNAs芯片筛选过表达MYC
，B细胞系P493-6中miRNA表达变化
。他们发现MYC诱导了mir-17-92的表达，而这些miRNAs可以抑制E2F1的翻译。在这一模型中 ，mir-17-92基因簇所起的作用似乎是抑癌基因的作用，这与上面讨论的He等人的发现是相反的 。这其中可能的机理是
，尽管E2F1可以促进细胞增殖，但是当E2F1的表达水平超过一阈值 ，它也可以引起凋亡
，在此情况下，miRNAs对于E2F1的负调控可能是通过阻断E2F1的诱导凋亡活性 ，从而促进MYC介导的细胞增殖
，支持了He等提出的模型
。

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